PCR为什么总是失败？——5个常见原因与解决办法 | 广州星耀国际官网生物科技有限公司

PCR（聚合酶链式反应）几乎是分子实验室里最常见的技术之一。但有时候，做着做着，条带就是不上镜：要么无条带，要么全是拖尾，要么阴性对照还神奇地亮了……🤯

别急！今天我们就来盘点 PCR失败的5个常见原因，并提供实用的解决办法，帮你少踩坑。

1️⃣ 模板DNA质量或浓度不合适

🔍 表现：无条带、条带过弱或拖尾。

📌 原因：DNA降解、杂质残留，或者浓度过低/过高。

✅ 解决办法：

保证DNA纯度（A260/A280 = 1.8–2.0）；

稀释过浓模板；

植物/土壤等样本建议用高纯度提取试剂盒。

2️⃣ 引物设计或浓度有问题

🔍 表现：非特异性条带、引物二聚体。
xxxxx

📌 原因：引物设计不合理，浓度过高/过低。
✅ 解决办法：

长度18–25 bp，GC含量40–60%；
避免3’端互补；
终浓度一般0.1–0.5 μM，必要时做梯度PCR优化。

3️⃣ PCR体系或酶活性问题

🔍 表现：完全无扩增或扩增效率低。
xxxxx

📌 原因：Taq酶失活、Mg²⁺浓度不合适、dNTP降解。
✅ 解决办法：

分装保存酶，避免反复冻融；
优化Mg²⁺浓度（1.5–2.5 mM）；
用新鲜dNTP；
推荐选择性能优异的PCR预混液 👉 预混液中已优化了缓冲体系和酶活性，能显著提升扩增成功率，减少反复调试的时间，非常适合常规科研实验。

4️⃣ 实验操作污染

🔍 表现：阴性对照也出现条带。

📌 原因：PCR产物残留、移液枪污染、空气中DNA污染。
✅ 解决办法：

严格分区操作（提取区/体系配置区/产物分析区分开）；
用带滤芯的枪头；
定期清洁实验台，使用核酸去除剂。

5️⃣ 循环条件设置不当

🔍 表现：条带模糊、非特异性扩增或无结果。
xxxxx

📌 原因：退火温度过低/过高、延伸时间不足、循环数过多。
✅ 解决办法：

根据引物Tm值设置退火温度；
延伸时间约 1 kb/min；
循环数控制在30–35次。

🧪 总结

PCR失败并不可怕，常见问题主要集中在 模板、引物、体系、操作和循环条件 这五个方面。逐一排查，总能找到原因。

而对于高校实验室或科研人员来说，选择一款高性能PCR预混液，往往能让PCR事半功倍，节省大量试错时间。

🔬 科研路上，少一点弯路，多一点高效！

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